Compte rendu CRIPSR

SOMMAIRE

Introduction1

1. Mécanisme du CRISPR2

1. Phase 1 : Immunisation2
2. Phase 2 : Immunité2

1. Modification et amélioration du système CRISPR 3

1. Conception de l'ARN guide3
2. Modifications de Cas94
3. HDR et NHEJ 5

1. Entreprises et Applications 5

1. CRISPR Therapeutics5
2. Beamedex7
3. Bases de données8

Conclusion9

Bibliographie10

Liens internet11

Introduction

A l’heure du séquençage de masse des génomes, la modification de l'expression des gènes et l’édition du génome (délétion, insertion, K.O) sont des domaines qui prennent de plus en plus d'importance. A ce jour, diverses approches sont utilisées : ARN interférence des eucaryotes, banques de cDNA, mutagénèse simple (UV) ou dirigée (transposon), mais aussi des techniques d’editing basée sur l’utilisation de nucléases ciblées comme les ZFN (Zing Finger Nuclease) et TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease). Avec l’évolution des nouvelles biotechnologies, un nouveau mécanisme s’est imposé pour réaliser de l’editing : le système CRISPR.

Découvert pour la première fois en 1987 chez la bactérie Escherichia coli puis mis de côté, ce n’est qu’en 2005 que le sujet à vraiment capté l’attention de la communauté scientifique. Depuis, énormément de recherches sont consacrées à la compréhension et la mise en application de ce processus.

Les chercheurs se sont rendu compte que cet organisme pouvait acquérir naturellement une résistance contre de l’ADN étranger tel que les plasmides et l’ADN viral. Cette résistance s’apparente à la réponse immunitaire acquise de l’Homme. Suite à l’entrée d’un ADN étranger, ce dernier s’intègre à l'intérieur de loci particuliers, les CRISPR (pour clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Ces clusters sont retrouvés chez 60% des bactéries et chez 100% des archées.

La bio-informatique et la génomique ont permis de déterminer la composition des CRISPR de manière très précise. Les CRISPRs contiennent des régions répétées (repeat) espacées par des séquences d’ADN étranger (spacer). Ils sont associés à d’autres gènes, les gènes Cas qui codent pour des protéines du même nom14. Grâce à l’expertise dans le domaine de la biologie moléculaire, le système bactérien a été adapté par les chercheurs afin d’être utile pour faire de l’editing dans divers organismes. Ce nouvel outil s’appelle le CRISPR-Cas9.

Cas9 est une enzyme qui peut être facilement programmée avec de l’ARN pour coupé de l’ADN en des sites cibles dans le génome avec une précision chirurgicale. Il permet aux scientifiques et aux cliniciens de muter et/ou de corriger des gènes cibles spécifiques, afin de lutter contre les maladies génétiques récessives ou dominantes. Le système CRISPR-Cas9 offre des avantages significatifs par rapport aux thérapies géniques traditionnelles qui, à ce jour, ont seulement été utiles pour corriger certains troubles génétiques récessifs.

Notre recherche bibliographique nous a permis d’en apprendre d’avantage sur ce mécanisme et sur les applications qui en découle. Au cours de ce rapport, nous allons vous expliquer le mécanisme original présent chez les bactéries et les archées. Dans une deuxième partie, nous vous expliquerons l’adaptation du mécanisme par les chercheurs pour le transformer en outil d’editing. Pour conclure, nous verrons où en sont les applications industrielles mais aussi celles de la recherche, quels sont les objectifs à terme de l’utilisation d’une telle technique et quels sont les points qui reste à améliorer.

1. Mécanisme du CRISPR

Il existe 3 types de CRISPR : type I, II et III. Le système de type II chez la bactérie se déroule en 2 phases. La première phase correspond à « l’immunisation » et la seconde à « l’immunité ».

1. Phase 1 : Immunisation

Le locus du système de type II est organisé de la façon suivante1, 16 (Figure 1) :

• crRNAs (CRISPR RNA) : séquences palindromiques répétées (environ 30 paires de bases) et ADN étranger (spacers)
• tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA) : s’associe avec le crRNA, active la coupure par la RNAse III et Csn2
• Gènes Cas :

• Cas1 et Cas2 : composants du complexe Cas
• Cas9 : Nucléase endogène composée de 2 domaines qui sont RuvC et HNH, effectue la coupure double brin sur l’ADN cible
• Csn2 : intervient dans la maturation par clivage du complexe pre-crRNA-tracrRNA

Lors d’une « primo-infection » par un phage ou un plasmide, l’ADN viral (ou plasmidique) se retrouve clivé en fragments, nommés spacers, par le complexe Cas. Ce complexe est constitué des protéines Cas1 et Cas2. Les spacers sont ensuite insérés au locus du CRISPR de type II à la fin du promoteur leader. Ils sont séparés par des séquences directes répétées. Cette étape peut-être nommée l’adaptation2.

1. Phase 2 : Immunité

Lors d’une seconde infection, la bactérie va utiliser l’information stockée au locus CRISPR pour se défendre. Le mécanisme se déroule en 3 grandes étapes (Figure 2).

Tout d’abord il va y avoir transcription d’un pré-crRNA (précurseur CRISPR RNA) et de tracrRNA. Le pré-crRNA est un long messager synthétisé à partir du locus CRISPR. Il est donc composé des spacers et des séquences répétées s’y trouvant. Dans un second temps, un appariement s’effectue entre les séquences répétées du pré-crRNA et les tracrRNA. La zone non appariée du tracrRNA forme une tige-boucle.

Par la suite la maturation du complexe pré-crRNA-tracrRNA est faite par la RNAse III et la Csn2 qui coupent les extrémités 5’ des spacers4. On obtient donc de courts crRNA. Un crRNA dispose d’environ 20 nucléotides du 3’ du spacer suivit de 19 à 22 nucléotides du 5’ de la séquence répétée. La taille optimale du spacer requise pour l’efficacité du système CRISPR-Cas9 est de 20 paires de bases. Mais seulement 12 paires de bases en 3’ du spacer sont suffisantes pour que cela fonctionne. Il y a environ 7 paires de bases qui sont cruciales en 3’ sur le crRNA pour sa fixation sur la cible. Cela correspond au « seed »5. Si on mute cette séquence alors il n’y a plus d’hybridation sur la séquence cible.

Enfin la Cas9 se lie au complexe crRNA-tracrRNA. L’ensemble s’hybride par simple liaison Watson Crick sur la séquence d’ADN cible : le protospacer. En plus de la séquence seed, la présence de la bonne séquence PAM (Protospacer Adjacent Motif) qui suit le protospacer est nécessaire à la coupure par la protéine Cas9. La séquence PAM est spécifique à l’espèce, par exemple NGG pour S. pyogenes.

Les 2 premières étapes peuvent être regroupées sous le nom d’expression. La dernière étape peut-être nommée interférence.

1. Modification et amélioration du système CRISPR

Outre sa fonction de défense chez les bactéries et les archées, les chercheurs se sont rapidement aperçus du potentiel que représentait le système CRISPR en génétique. Après diverses modifications le système peut être utilisé pour la caractérisation et l'étude de la fonction d'un gène.

1. Conception de l'ARN guide

Nous avons vu dans la partie précédente que chez les bactéries et les archées, le complexe crRNA-tracrRNA est formé à partir de l'hybridation d'un ARN CRISPR (crRNA), possédant un fragment d'ADN étranger, et d'un ARN CRISPR transactivateur (tracrRNA) transcrit séparément (Figure 3a).

Afin qu’il soit applicable au règne eucaryote, il est possible d’exprimer de manière séparée le crRNA et le tracrRNA comme tel est le cas chez les procaryotes. Cependant cela reste moins efficace qu’une fusion directe entre les 2 séquences. L’une des modifications réalisée à donc été d’exprimer par fusion ces séquences pour former ce que l’on appelle communément l’ARN guide11 (Figure 3b). Ceci permet d'améliorer non seulement l'efficacité mais aussi la simplicité des expériences d'editing car il suffit simplement de modifier les 20 nucléotides en 5' pour que la Cas9 puisse ciblée n'importe quel séquence d'ADN.