Enoncé TP neuro physiologie

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TP L2 – Neurobiologie cellulaire et Physiologie Techniques de Neuroanatomie

Mise en évidence de la structure du tissu nerveux par coloration histologique de Nissl

Objectif du TP :

Vous devrez mettre en évidence certaines structures cérébrales. Vous utiliserez pour cela la coloration au violet de crésyl et au rouge neutre sur des coupes de cerveau de rat.

Compte-rendu :

À travailler lors de toutes les séances ; à rendre lors de la dernière séance de TD.

1. Compte-rendu des manipulations (un par sous-groupe)

• Introduction

🡪 Rappeler le but du TP et le principe des techniques utilisées

• Matériel et méthodes

🡪 Décrivez et justifiez les différentes étapes des expériences réalisées ainsi que le matériel biologique utilisé.

• Résultats

🡪 Vous illustrerez vos résultats par des dessins d’observation légendés d’une coupe (observation macroscopique et observation microscopique). 4 dessins au total.

• Conclusion

🡪 Intérêts de la technique

1. Reproduction de dessin ME (un par étudiant)

🡪 Reproduisez au calque un dessin de coupe de microscopie électronique et légendez.

1. Question (un par sous-groupe)

🡪 On veut mettre en évidence les neurones sur des coupes de cerveaux de souris adultes. Les neurones expriment des épitopes tels que NeuN et βIII-Tubuline. Décrivez le protocole que vous utiliseriez étape par étape.

1. Étude du SNC

Séance 1 : Préparation des échantillons[pic 3]

1. Préparation solution

- Alcools : 70°, 80°, 90°, 95° (1 L) (pour la séance 2)

- PB 0.1M

- Eau gélatinée 0.2% (50 mL)

1. Étape préalable : perfusion et fixation (réalisés par l’enseignant)

Des rats Sprague-Dawley ont été préalablement perfusés pour permettre la fixation des tissus ; le cerveau a été prélevé, et maintenu pendant 24h dans du paraformaldéhyde (4%) puis dans une solution tampon phosphate à 30 % de sucrose.

1. Coupes de cerveaux

Solutions disponibles : Phosphate Buffer (PB) 0,1M

Matériel spécifique : Microtome

• Préparez 10 piluliers de solution de PB 0,1M. Identifiez les piluliers 1 à 10.
• Coupez la base du cerveau (cervelet) et placez-le sur la platine en le fixant à l’aide de la solution de saccharose.
• Réalisez des coupes de 50 µm et placez les coupes alternativement dans chacun des 10 piluliers.

1. Montage des coupes

• Placez le contenu d’un pilulier dans une boîte de pétri avec PB (0,1M)
• Faîtes tremper la coupe dans de l’eau gélatinée 0.2% à l’aide d’un pinceau puis étalez-la sur la lame
• Identifiez les lames : Nom, prénom, date, groupe de travail, numéro de lame (n°/nombre total) = une lame/étudiant

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• Séchez la lame

Séance 2 : Coloration au crésyl violet[pic 5]

**** TRAVAIL SOUS LA HOTTE ****

1) Coloration crésyl violet (10 min)

2) 2x H20 (2x 3 min, eau à changer à chaque fois)

3) Déshydratation :

• 2x Ethanol 70° (2x 1 min)
• 1x Ethanol 80° (1 min)
• 2x Ethanol 90° (2x 1 min)
• 2x Ethanol 95° (2x2 min)
• 2x Ethanol absolu (= 100°) (2x 2 min)
• 2x Toluène (1x 1 min puis 1x 10 min)

3) Montage entre lame et lamelle avec du DEPEX

4) Séchage

Séance 3 : Observation des coupes et analyse des résultats[pic 6]

Utilisez les microscopes mis à votre disposition pour réaliser des dessins d’observation permettant d’illustrer les structures d’intérêt que vous avez mis en évidence avec ce marquage. Dessiner 2 coupes (1 striatum et 1 hippocampe) observées à l’œil nu et à l’objectif X10, en localisant les structures de l’atlas et le marquage. (donc 4 dessins en tout)

Ces dessins d’observations devront être intégrés et commentés dans la partie « Résultats » de votre compte-rendu.

1. L’immunohistochimie

Cette technique permet de localiser des molécules (épitopes, antigènes) dans du matériel vivant. Le réactif principal est un anticorps dirigé contre un épitope d’intérêt. Des molécules visibles (traceurs) fixés directement ou indirectement sur cet anticorps permettent de révéler cette interaction antigène-anticorps.

1. PRINCIPE GÉNÉRAL D’UNE RÉACTION IMMUNOHISTOCHIMIQUE

Une immunoréaction (ou réaction immunohistochimique) se compose de trois éléments :

1. La préparation des tissus, cellules, organites, virus, etc, contenant l’antigène à étudier.
2. Un anticorps dirigé contre l’antigène recherché.
3. Le système révélateur (ou traceur) qui permet de visualiser l’immunoréaction.

La qualité des résultats dépend de l’utilisation judicieuse de ces trois éléments.

1. Préparation des tissus

Plusieurs traitements sont utilisés en fonction du tissu et du marquage effectué.

*La fixation

Elle permet de figer les structures protéiques et d’immobiliser les antigènes in situ. On trouve notamment : les fixateurs déshydratants (alcools, chaleur…) qui précipitent les protéines ; les aldéhydes, des agents de pontage chimique immobilisant les molécules (formaldéhyde, glutaraldéhyde…) et les composés métalliques (zinc et mercure).

*La congélation

Elle permet de réaliser des coupes relativement fines, les tissus étant durcis par la congélation. Les techniques de congélation utilisées en immunohistochimie visent à diminuer la formation de cristaux, normalement observés si le refroidissement est lent.

*L’inclusion

L’inclusion n’est utilisée que dans le but d’effectuer des coupes fines (< 10µm) à ultra-fines (< 5µm) (par exemple pour une observation en microscopie électronique). Elle consiste à infiltrer le tissu par un milieu liquide à chaud qui durcit en refroidissant (ex : la paraffine), ou en polymérisant (ex : les résines) ou en desséchant (ex : la gélatine).

1. Les anticorps

Les anticorps sont les réactifs essentiels des réactions immunohistochimiques.

Dans l’organisme, ils sont naturellement produits pour protéger l’organisme contre l’inclusion des corps étrangers par des mécanismes de reconnaissance et de mémorisation spécifiques des antigènes. Ces mécanismes sont notamment assurés par les lymphocytes B, qui sécrètent les immunoglobulines (Ig) ou anticorps qui fixent l’antigène et constituent ainsi l’outil de base de nos réactions immunitaires.

Il existe deux grandes classes d’anticorps utilisées en immunohistochimie :

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