Biologie cellulaire / Obtention et analyse d'un ADN plasmidique

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BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE

COMPTE-RENDU DES TRAVAUX PRATIQUES 1 ET 2

Obtention et analyse d’un ADN plasmidique

Table des matières

1. Introduction…………………………………………………………….3

1. Matériels et méthodes………………………………………………..4

1. Résultats et discussion……………………………………………….5

1. Conclusion……………………………………………………………10

Liste des figures

Figure 1: Organigramme du protocole de l'obtention et analyse de l'ADN plasmidique……………………………………………………………4

Figure 2: Electrophorèse de pSVT coupé par EcoR1 (puits 2, 4, 6 et 8) et coupé par EcoR1 + Sca1 (puits 3, 5, 7 et 9).......................................5

Figure 3: Electrophorèse de pSVT avec l'alignement des bandes……..7

Figure 4: Graphique de la taille logarithmique (en kb) en fonction de la distance des bandes avec les puits (en cm)...........................................8

Figure 5: Carte de restriction du plasmide pSVT………………………..10

Liste des tableaux

Tableau 1: Observation des distances des bandes de pSVT suite à l'électrophorèse………………………………………………………………8

Tableau 2: Données obtenues à l'aide du graphique logarithmique……9

1. Introduction

Un plasmide est une molécule d’ADN distincte de l’ADN chromosomique, qui est capable de réplication autonome et est non essentiel à la survie de la cellule. Les plasmides sont bicaténaires et généralement circulaires, on les retrouve principalement chez les bactéries. Lors des travaux pratiques, nous avons travaillé sur la bactérie Escherichia coli K12, qui contient pour ce TP le plasmide étudié, nommé pSVT. Afin de pouvoir analyser pSVT, nous avons effectué trois grandes étapes que nous allons détailler ci-dessous.

Pour commencer, nous avons utilisé la méthode Boiling afin d’extraire le plasmide de la bactérie. L’extraction permet de libérer le matériel génétique dans le milieu. La méthode Boiling consiste à faire bouillir l’échantillon dont les cellules ont été préalablement lysées avec du STET, un mélange de 4 réactifs qui possède plusieurs fonctions, et du lysozyme. En effet, le Saccharose facilite l'expulsion du cytoplasme par pression osmotique, le Triton permet la solubilisation des protéines et la destruction de la membrane grâce à ses propriétés de détergent en déstabilisant les bicouches lipidiques, l'EDTA inhibe les DNAses et perméabilise les cellules, le Tris fait office de tampon en maintenant le pH à 8,0 et enfin le lysozyme hydrolyse les peptidoglycanes. Ainsi, les produits de lyse sont incubés à haute température, dénaturant les protéines membranaires mais également l'ADN plasmidique, qui peut être renaturé en conservant le tube utilisé sur de la glace pendant 2 minutes. Une fois centrifugés, les débris cellulaires autres que l'ADN plasmidique et l'ARN, comme l'ADN chromosomique, précipitent au fond pour former le culot. Le surnageant contenant le matériel génétique sera donc récupéré.

Par la suite, nous avons effectué des digestions avec des endonucléases de restriction qui vont couper l’ADN en des sites bien précis. Nous avons donc obtenu des fragments qui nous ont permis d’estimer la taille du pSVT. Nous avons fait une digestion simple avec l’endonucléase EcoR1 et une digestion double avec deux endonucléases : EcoR1 + Sca1.

Enfin, les pSVT digérés ont été analysés par électrophorèse, ce qui nous a permis de visualiser les molécules d’ADN grâce à un composé fluorescent.

1. Matériels et méthodes

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Figure 1: Organigramme du protocole de l'obtention et analyse de l'ADN plasmidique.

Cette représentation schématique détaille les étapes du protocole que nous avons appliqué lors des travaux pratiques.

1. Résultats et discussion

L'objectif de l'expérience est d'extraire le plasmide de pSVT afin de pouvoir l'analyser par électrophorèse.

Le principe de l'électrophorèse consiste à soumettre pSVT à un champ électrique afin d'entraîner une migration des molécules d'ADN chargées négativement vers le pôle positif dans du gel d'agarose. Dans ce composé les fragments d'ADN migrent à des vitesses qui dépendent de 4 paramètres principaux : le poids moléculaire des fragments d'ADN, la conformation des molécules d'ADN, la concentration du gel en agarose et l'intensité du courant qui traverse le gel. Cette migration permettra d'identifier la taille des fragments d'ADN à l'aide de l'échelle ADN et d'un graphique logarithmique.

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Figure 2: Electrophorèse de pSVT coupé par EcoR1 (puits 2, 4, 6 et 8) et coupé par EcoR1 + Sca1 (puits 3, 5, 7 et 9).

Les puits 1 et 10 représentent l'échelle d’ADN.

Nos résultats se trouvent dans les puits 2 et 3.

Pour commencer, nous pouvons remarquer que nos puits sont très peu fluorescents, ce qui nous indique que nos échantillons possédaient très peu de chromosomes bactériens. Les ARN sont visibles en bas des puits puisqu'ils ont été purifiés par la méthode Boiling. On remarquera qu'ils sont très présents notamment dans le puits 3, mais ils ne sont pas gênants car nous n'étudions pas de bandes à leur niveau. Nous pouvons également remarquer que nos bandes sont très épaisses et forment un "W". Ces informations nous permettent de dire que nos échantillons possédaient trop d'ADN et donc qu'ils ont migré beaucoup plus vite qu'ils ne devraient. Ce qui est normal puisque les ARN contribuent à la survitesse du "W" car ils migrent plus vite que l'ADN.

En comparant avec les résultats des autres binômes, on constate une nette différence de vitesse de migration. Cela se remarque principalement par la forme "W" beaucoup moins prononcée sur les autres puits.

On observe plus précisément que les bandes des puits 8 et 9 sont plus hautes sur l'électrophorèse et sont totalement droites. Cela s'explique par l'absence d'ARN au niveau du front de migration, ce qui a permis à l'ADN de migrer à son propre rythme, sans être entraîné.

Nous nous sommes donc particulièrement intéressées à ces puits, tout en les comparant avec les nôtres.

Pour obtenir les bonnes valeurs de taille de pSVT, il faudra donc que l'on aligne nos bandes avec celles des binômes afin d'avoir des distances correctes.

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Figure 3: Electrophorèse de pSVT avec l'alignement des bandes.

Pour mesurer la distance en cm entre les puits et les bandes, nous avons imprimé la figure puis mesuré de la base du puits à la base de la bande, la base étant le côté vers le pôle positif.

Nous avons d’abord estimé les tailles de nos bandes en kb grâce à l’échelle d’ADN de gauche et l’alignement des autres bandes.

Puis, pour apporter plus de précision à nos résultats et à notre interprétation, nous avons mesuré la distance en cm avec le puits 10 pour chaque bande de l’échelle d’ADN de droite. Ces mesures nous ont servi à construire la droite du logarithme de la taille en fonction de la distance indiquée précédemment de pSVT.

Nous avons également mesuré la distance des bandes des puits 2, 3, 8 et 9 comme indiqué dans le tableau 2. Nous avons finalement utilisé cette droite pour déterminer graphiquement la taille des bandes et comparer ces données avec celles obtenues auparavant.

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