Purification Du Lysozyme

écule.

DO = log(1/T) = (LC

( est le coefficient d’extinction molaire, caractéristique de la substance, à la longueur d’onde choisie

L est le trajet optique, généralement égal à 1cm

C est la concentration de la substance à doser

Préparation des tampons

Tampon d'équilibration de volume final 250 mL dont la composition finale est NaCl 0,05 M et Tris-HCl 0,05 M à pH 8,2, à partir des solutions A et B.

A: NaCl 0,5M et B: Tris Hcl 0,5 M, pH 8,2

C= n/V

Vt= 250 mL

nA= 250 x 10 -3 x 0,05 = 1,25 x 10-2 moles

nB= 250 x 10 -3 x 0,05 = 1,25 x 10-2 moles

donc VA = nA/ CA = 1,25 x 10-2 / 0,5 = 2,5 x 10-2 l = 25 mL

et VB = nB/ CB = 1,25 x 10-2/ 0,5 = 2,5 x 10-2 l = 25 mL, à diluer dans 200 mL d'eau.

Tampon d'élution, de volume final 40 mL dont la composition finale est 0,2 M pH 10,5 de carbonate, à partir des solutions A' et B'.

A': 0,2 M de carbonate de sodium et B': 0,2 M de bicarbonate de sodium de pH 10,3.

pH = pKa + log (B'/A')

10,5 = 10,3 + log (B'/A')

0,2 = log (B'/A')

et A' + B' = 0,2

B' = 0,2 - A'

1,585 A' = 0,2 – A'

A' = 0,2 / 2,585 = 7,74 x 10-2 M

VA'= 15,4 mL = 15 mL

VB' = 24,6 mL = 25 mL

|Fractions |Volume |Concentration protéique |Protéines totales |Activité enzymatique |

| |mL |mg.mL-1 |mg |U/aliquot |

|1 |20 |1,08 |1,9 |-0,0585 |

|2 |100 |1 |1,9 |-0,0047 |

|3 |100 |1 |1,9 |0 |

|4 |100 |1 |1,9 |0 |

|5 |100 |1 |1,9 |0 |

|E1 |30 |1,07 |1,9 |-0,0411 |

|E2 |30 |1,07 |1,9 |-0,1458 |

| | | | |dilué -0,0287 |

|E3 |30 |1,07 |1,9 |-0,0127 |

|E4 |30 |1,07 |1,9 |0 |

|E5 |30 |1,07 |1,9 |0 |

|E6 |30 |1,07 |1,9 |0 |

Gamme étalon pour le dosage de protéines

|Tubes |Prise d'essai |Volume eau |Absorbance |Qté de protéines |

|1 |0 |500 |0,462 |0 |

|2 |20 |480 |0,039 |2 |

|3 |40 |460 |0,094 |4 |

|4 |60 |440 |0,154 |6 |

|5 |80 |420 |0,209 |8 |

|6 |100 |400 |0,264 |10 |

Dosage des protéines dans nos fractions et éluats récupérés

|Fractions |Prise d'essai |Volume eau |Absorbance |Qté protéines/aliquot |

|F1 |30 |470 |0,392 |14,7 |

|F2 |30 |470 |0,231 |8,8 |

|F3 |10 |490 |0,379 |14,3 |

|F4 |10 |490 |0,041 |1,55 |

|F5 |10 |490 |0,021 |0,8 |

|E1