Separation De l'Alanine Et De l'Arminien Sur Résine Échangeuse d'Anions

absorption de l’espèce chimique à étudier.

Concernant la mise en evidence de l’arginine, il s’agit d’une réaction spécifique où en présence d’alpha-naphtol et d’hypobromite de sodium en milieu alcalin, l’arginine donnera une coloration rouge orangé.

3. MODE OPERATOIRE

Notre mélange à chromatographier est le mélange B.

Pour préparer 10 mL de la solution standard d’alanine à 20 g.mL-1 à partir de la solution mère à 80 mg.200 mL-1 :

80mg / 200mL 0,4mg / mL 400g / mL

Sachant que notre solution doit être à 20g / mL, il nous suffit de trouver le facteur de dilution : 400g / 20g = 20 le facteur de dilution est 20.

1mL / 20 = 0,05mL

On veut 10mL de cette solution : 10mL / 20 = 0,5mL

On a donc pipeté 0,5mL de notre solution mère, que l’on a diluée en ajoutant 9,5mL d’eau distillée.

Les 10mL de la solution standard à 20 g.mL-1 vont être utilisés pour la gamme étalon.

Lors de la préparation du réactif à la ninhydrine, on ajoute les 3mL de tampon acétate 4 mol.L-1 pH 5,5 seulement au dernier moment, car lorsque l’on va l’ajouter, le réactif va réagir, et si on le laisse agir trop longtemps, le réactif censé colorer la solution en jaune, va de plus en plus se décolorer jusqu’à perdre sa coloration. Sans la coloration, les mesures d’absorbance au spectrophotomètre sont impossibles.

Pour la mise en évidence de l’arginine, on nous demande de préparer 10mL d’-naphtol à 0,1% , ce qui équivaut à une concentration de 0,1g / 100mL, dans un mélange éthanol-eau dans les proportions 50:50.

0,1g / 100mL 0,01g / 10mL 10mg / 10mL

On va donc peser 10mg d’-naphtol que l’on va dissoudre dans 10mL du mélange éthanol-eau (50:50).

4. RESULTATS ET DISCUSSION

Gamme étalon :

Tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |

Alanine 20g/mL mL | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1 | | | |

Eau distillée mL | 1 | 0,8 | 0,6 | 0,4 | 0,2 | 0 | | | |

Réactif ninhydrine mL | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |

Absorbance lue | 0,383 | 0,490 | 0,571 | 0,659 | 0,746 | 0,908 | 0,516 | 0,636 | 0,393 |

Absorbance réelle | 0 | 0,107 | 0,188 | 0,276 | 0,363 | 0,525 | 0,123 | 0,243 | 0 |

Le tube 1 équivaut au blanc de cette gamme étalon car il contient seulement les réactifs. On a donc soustrait son absorbance à celle des autres tubes pour trouver leur absorbance réelle, autrement dit, l’absorbance seulement en fonction de la concentration en alanine.

Le tube 9 équivaut au blanc de ces tubes car il contient seulement les réactifs. On a donc soustrait son absorbance à celle des tubes 7 et 8 pour trouver leur absorbance réelle, autrement dit, l’absorbance seulement en fonction de la concentration en filtrat.

La variation de l’absorbance est proportionnelle à la quantité en alanine.

Droite étalon : cf annexe

Les différentes formes ioniques de l’Alanine et de l’Arginine :

A pH = 4,2 Arginine sous forme cationique

A pH = 4,2 Alanine sous forme neutre

* Pour l’arginine

pH = pKa + logArg+Arg2+↔4,2-2,17=logArg+Arg2+

↔2,03= logArg+Arg2+ ↔ 102,3=Arg+Arg2+ ↔107,15= Arg+Arg2+

Sachant que : [Arg+] + [Arg2+] =100%

Et 107,15 x [Arg2+] = [Arg+]

D’où : [Arg2+] + 107,15 [Arg2+] = 100

[Arg2+] = 100108,15=0,92

Soit 0,92% de [Arg2+] à pH = 4,2 et donc 99,08% de [Arg+]

* Pour l’alanine :

pH = pKa + logAla0Ala+↔4,2-2,34=logAla0Ala+

↔1,86= logAla0Ala+↔ 101,86=Ala0Ala+ ↔72,44= Ala0Ala+

Sachant que : [Ala0] + [Ala+] = 100%

Et 72,44 x [Ala+] = [Ala0]

D’où : [Ala+] + 72,44[Ala+] = 100

[Ala+] = 10073,44=1,36

Soit 1,36% de [Ala+] à pH = 4,2 et donc 98,64% de [Ala0]

Au cours du lavage, l’arginine est fixé par la colonne et l’alanine est entrainé par le tampon (car sous forme Ala0 majoritairement).

Au cours de l’élution, le pH augmente car on utilise la soude à 1M, donc Arg va passer sous forme anionique et se désorber de la résine.

pHsoude = 14 + log [C] car soude = base forte

= 14 + log (1)

= 14

Donc à pH = 14 :

* Pour l’arginine

pH = pKa + logArg-Arg0↔14-12,48=logArg-Arg0

↔1,52= logArg-Arg0↔ 101,52=Arg-Arg0 ↔33,11= Arg-Arg0

Sachant que : [Arg0] + [Arg-] =100%

Et 33,11 x [Arg0] = [Arg-]

D’où : [Arg0] + 33,11[Arg0] = 100

[Arg0] = 10034,11=2,93

Soit 2,93% de [Arg0] à pH = 14 et donc 97,07% de [Arg-]

pH des tampons | Alanine (A) | Arginine (R) |

Tampon acétate0,1M et pH = 4,2 | A+ => 1,36% A0 => 98,64% | R2+=> 0,92% R+ => 99,08% |

pH de la soude à 1M = 14 | | R0 => 2,93%R- => 97,07% |

Tableau des proportions des formes ioniques en présence des différents tampons

D’après ce tableau nous pouvons donc dire que l’Arginine va rester fixée à la colonne (lors de la mise en colonne des acides aminés et du lavage) alors que l’alanine ne vas pas s’accrocher à la colonne durant le lavage (1ier éluat)

L’arginine va donc finir par être élué par la soude dans un second éluat.