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saire :

Un tampon phosphaté pH 7 (avec Mg2+ et β-ME)

De l'ONPG à pH 7 à 2,5mmol.L-1

Une solution enzymatique de β-galactosidase

D'une pipette de 200-1000µL et de 1-5 mL + cônes adaptés

D'un vortex

Des béchers (pour l'ONPG, le réactif d'arrêt et la solution tampon)

D'un bac de glace (pour maintenir l'ONPG et l'enzyme à faible température)

Pour la méthode en continu, nous avons besoin :

D'un spectrophotomètre thermostaté à 30°C

D'un chronomètre

D'une cuve à spectrophotomètre

Du parafilm

Pour la méthode par points, il faut :

Un spectrophotomètre

Un bain thermostaté à 30°C

10 tubes à hémolyse

Du réactif d'arrêt (Na2CO3 à 1mol.L-1 qui amène le pH à 11)

2 cuves différentes à spectrophotomètre

Méthodes

Méthode en continu

Cette méthode est mise en œuvre quand le produit ou le substrat absorbe. Dans ce cas-là, on détermine la vitesse initiale grâce à la pente de la partie linéaire de la courbe P=f(t).

Cette méthode consiste à introduire dans une cuve à spectrophotomètre 0,4mL de substrat (l'ONPG) et 2,4mL de solution tampon à pH7 ensuite préchauffés dans le spectrophotomètre thermostaté afin que le milieu réactionnel soit à bonne température. Puis 200µL d'enzyme (la β-galactosidase) sont introduits dans la cuve et on mesure l’absorbance du milieu régulièrement pendant 15 minutes. Ainsi on établit une courbe de l'absorbance en fonction du temps. La pente de la partie linéaire de la courbe (première partie) permet de déterminer la vitesse initiale de réaction.

Méthode par points

Cette méthode consiste à arrêter la réaction à différents temps en inactivant l'enzyme grâce à du réactif d'arrêt (ici le carbonate de sodium). On dose ensuite le produit formé ou le substrat disparu.

Dans 11 tubes à hémolyse, on introduit 0,4mL de substrat (l'ONPG) et 2,4mL de tampon phosphaté à pH7. Le mélange est préchauffé au bain thermostaté à 30°C pendant 5 minutes. Puis durant 20 minutes, les tubes toujours placés au bain marie, on ajoute à différents temps 200µL d'enzyme (la β-galactosidase) et 2mL de réactif d'arrêt (le carbonate de sodium Na2CO3). Ainsi la durée d'incubation diffère pour chaque tube et on mesure l'absorbance au spectrophotomètre de chaque tube permettant d'établir la courbe de l'absorbance en fonction du temps d'incubation.

Tubes n° | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Enzyme à t=... (min) | 0 | 0,5 | 1 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3 | 3,5 | 4 | 4,5 |

Réactif d'arrêt à t=... (min) | 20 | 17,5 | 15 | 12,5 | 11 | 9,5 | 8 | 6,5 | 6 | 5,5 |

Temps d'incubation | 20 | 17 | 14 | 11 | 9 | 7 | 5 | 3 | 2 | 1 |

De la même façon, la pente de la partie linéaire détermine la vitesse initiale de réaction.

Attention, pour cette méthode, il est essentiel de faire un « blanc » contenant le même milieu que dans les autres tubes. Cependant, l'enzyme doit être ajoutée après le réactif d'arrêt afin qu'aucune réaction n'ait lieu entre le substrat et l'enzyme.

Résultats

Méthode de mesure en continu

Tableau de valeurs

Temps (minutes) | 0 | 0,5 | 1 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3 | 3,5 |

Absorbance à 415nm | 0.085 | 0.098 | 0.117 | 0.141 | 0.166 | 0.189 | 0.212 | 0.236 |

Temps (minutes) | 4 | 4,5 | 5 | 5,5 | 6 | 6,5 | 7 | 7,5 |

Absorbance à 415nm | 0.259 | 0.278 | 0.301 | 0.322 | 0.341 | 0.360 | 0.379 | 0.396 |

Temps (minutes) | 8 | 8,5 | 9 | 9,5 | 10 | 10,5 | 11 | 11,5 |

Absorbance à 415nm | 0.413 | 0.429 | 0.445 | 0.459 | 0.474 | 0.486 | 0.499 | 0.511 |

Temps (minutes) | 12 | 12,5 | 13 | 13,5 | 14 | 14,5 | 15 | |

Absorbance à 415nm | 0.523 | 0.534 | 0.544 | 0.554 | 0.563 | 0.572 | 0.580 | |

Graphique (annexe 1)

Calculs

D’après la loi de Beer-Lambert A = ε . l . C

Avec A : Absorbance (sans unité)

ε : coefficient d’extinction molaire (en L.mol-1.cm-1)

l : longueur de la cuve (en cm)

C : concentration de la solution (en mol/L)

Alors sachant que dans notre situation on détermine l’absorbance du 2-NitroPhénol (OPN) à 415nm afin de connaître la concentration en ONP , on a :

A415 = ε . l . CONP

Donc ΔA/ min = ε pH7. L . ΔC/min

On recherche la concentration en ONP soit

ΔC/min = ((ΔA/ min) / ε pH7 . l)

avec ΔC/min en moles ONP/min / L de ML (ML : milieu de lecture) simplement nous avons 3mL de milieu de lecture donc

ΔC/min = ((ΔA/ min) / ε pH7 . l ) . 3.10-3

où ΔC/min est en moles ONP/min / 3 mL de milieu de lecture. 3mL de milieu de lecture correspond à 200µL de solution enzymatique et on souhaite avoir dans 1mL de solution

enzymatique donc on a :

ΔC/min = ((ΔA/ min) / ε pH7 . l ) . 3.10-3 . 5 où ΔC/min est cette fois ci en moles ONP/min / mL de solution enzymatique.

Pour obtenir des U/mL il faut des µmoles donc

ΔC/min = ((ΔA/ min) / ε pH7 . l ) . 3.10-3 . 5.106

On a alors ΔC/min en µmoles ONP/min / mL de solution enzymatique ce qui correspond à des U/mL.

Avec nos valeurs :

On a ΔA/ min = 4,606.10-2

ε pH7 = 2120 L.mol-1.cm-1

l = 1 cm

alors ΔC/min = (4,606.10-2 / 2120 ) . 3.10-3 . 5.106

= 0,33 µmoles ONP/min / mL de solution enzymatique

0,33 U/mL .

Méthode de mesure par points

Tableau de valeurs

Tubes n° | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

200 µL β-galactosidase à t=… (min) | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 | 4 | 4.5 |

2 mL Na2CO3 à t=… (min) | 20 | 17.5 | 15 | 12.5 | 11 | 9.5 | 8 | 6.5 | 6 | 5.5 |

Temps d’incubation (min) | 20 | 17 | 14 | 11 | 9 | 7 | 6 | 3 | 2 | 1 |

A à 415 nm | 0.689 | 0.345 | 0.314 | 0.284 | 0.255 | 0.226 | 0.205 | 0.154 | 0.110 | 0.069 |

CONP milieu réactionnel (µmol.L-1) | 0 | 75.3 | 68.6 | 62.0 | 55.7 | 49.3 | 44.8 | 33.6 | 24.0 | 15.1 |

Graphique (annexe 2)

Calculs

D’après

...

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