Rapport mitochondries

Université de Montréal

Rapport mitochondries

Par

Ben Ahmed Skander

Hamraoui Mohamed

Équipe B39

Baccalauréat en Bio-informatique

Faculté des arts et sciences

Travail présenté à

Lian Mignacca

Dans le cadre du cours BCM1521

26 mars 2018

Résumé

Les mitochondries sont des organites essentiels dans le processus énergétique de la cellule. Les réactions qui s’y produisent pour fournir l’énergie constitue la respiration cellulaire par l’intermédiaire de la chaine de transport d’électrons. Elle est constituée de plusieurs complexes protéiques transmembranaires pour le transport d’électrons ou d’hydrogènes, provenant des réactions oxydatives. Cela génère un gradient de protons qui permettra la synthèse d’ATP. Le but de cette expérience est l’étude de la chaine respiratoire de la mitochondrie. Tout d’abord, on procède par l’isolation des mitochondries en homogénéisant le cœur de porc dans une solution hypotonique, ensuite par centrifugation, précipitation à l’acide acétique et lyse au Potter-Elvehjem. Un spectre différentiel sera produit par la suite par l’absorption des cytochromes présent dans la chaines pour vérifier leurs présences et intégrités. Six pics ont été identifié et corresponde aux cytochromes intègres. Ensuite, on étudiera la réduction du DPIP et l’oxydation du DPIPH2 de la chaine respiratoire par spectrophotométrie pour trouver les complexes impliqués. À la suite de l’expérience, on a déduit que la réduction du DPIP se situé entre le complexe 2 et 3 et que l’oxydation du DPIPH2 entre le complexe 3 et 4. Les mitochondries isolées et ses cytochromes sont bien présents et intègres d’après les résultats et leurs comparaisons.

Introduction

Le but de cette expérience est d’étudier les aspects du fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. Ces aspects sont l’intégrité des cytochromes, la réduction et l’oxydation du DPIP par la chaîne respiratoire. Ainsi que les effets de l’ajout de différents inhibiteurs sur celle-ci et les complexes. Cette chaîne respiratoire, qui est formée d’enzymes membranaires et de transporteurs d’électrons, a comme rôle le transfert d’électrons, provenant de réactions oxydatives, ce qui va créer un gradient de protons. Par la suite, l’ATP synthase va utiliser ce gradient de protons pour générer de l’ATP.

La voie respiratoire utilise quatre complexes protéiques transmembranaires pour le transport d’électrons ou d’hydrogènes, provenant des réactions oxydatives. Les enzymes de cette chaîne respiratoire sont situées dans la membrane interne de la mitochondrie. Le complexe I ou la NADH déshydrogénase est la première enzyme de cette voie métabolique. C’est la voie d’entrée des électrons possédant un haut potentiel d’énergie dans la respiration cellulaire et la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. Elle récupère les électrons du NADH et permet le transport de 4 protons qui viennent de la matrice mitochondriale et se dirigent vers l’espace inter-membranaire.^[1] Le complexe II ou la succinate déshydrogénase est le deuxième point d’entrée des électrons dans la chaîne respiratoire. Cette enzyme appartient aussi au cycle de KREBS. Dans ce complexe, il y a récupération des électrons du FADH2. Cependant, il n’y a pas de transport de proton dû au manque d’énergie libérée par les réactions. Elle catalyse l’oxydation de la succinate en fumarate. Le complexe III ou la Coenzyme Q-cytochrome c oxydoréductase est l’enzyme qui suit le complexe II. Parmi les composés de ce dimère de deux complexes, on retrouve trois cytochromes par sous-unité, soit un cytochrome c1 et deux cytochromes b. Parmi les composants du cytochrome important dans les réactions d’oxydo-réduction, on retrouve au moins un atome de fer ou de cuivre. Les deux états que peut prendre l’atome de fer dans ce complexe, c’est-à-dire l’état ferreux ou ferrique, permet le transport des électrons à travers la protéine. Ce complexe catalyse l’oxydation de la molécule d’ubiquinol Q10H2. Par l’enzyme, les électrons sont transférés vers le cytochrome c. Cette énergie qui est dégagée par l’oxydo-réduction, est utilisée par l’enzyme pour pompée les protons vers l’espace inter-membranaire, depuis la matrice. La dernière protéine qui conclue la chaîne respiratoire mitochondrial est le complexe IV ou également nommée cytochrome c oxydase. Elle est un dimère et elle constitué des cytochromes a et a3, également des ions métalliques comme le cuivre. Les électrons qui proviennent du cytochrome c, sont catalysés ensuite par l’enzyme vers une molécule d’oxygène O2. Cette réaction d’oxydo-réduction va former deux molécules d’eau et permet à l’enzyme de pompée les protons vers l’espace inter-membranaire. Le transfert des électrons et le pompage des protons, par les complexes I, III et IV au long de la voie métabolique, va conduire à une différence en concentration de protons, nommée gradient de concentration. La variation d’énergie libre provenant du transfert d’électrons entre les complexes est utilisée pour pomper les protons dans l’espace inter-membranaire. L’énergie libérée par les réactions d’oxydation de la chaîne respiratoire est emmagasinée pour ensuite être utilisé dans le processus de la phosphorylation oxydative qui permet la phosphorylation de l’ADP en ATP.

Dans cet extrait mitochondrial, on remplace l’oxygène par le DPIP comme accepteur final d’électrons dans la chaîne de transport. Le DPIP (2,6-dichlorophénol indophénol) est un accepteur d’électrons. Il peut être dans la forme oxydée, c’est-à-dire que c’est un accepteur d’électrons. À cette forme, il est de couleur bleu. Il peut être également sous la forme réduite, donc un donneur d’électrons. Il devient donc DPIPH2 et devient incolore. Une des raisons pourquoi on utilise le DPIP, est qu’il n’est pas réduit au même endroit que l’oxygène dans la chaîne, soit le complexe IV. Avec l’ajout de différents inhibiteurs, qui vont arrêter le transport d’électrons, on va permettre de trouver à quel endroits la réduction à lieu dans la chaîne. Si le DPIP devient incolore, la réduction a donc lieu, et par le fait même le complexe inhibé et les complexes suivants ne sont pas impliqués dans la chaîne. En revanche, si le DPIP reste bleu, cela signifie qu’il n’y a pas eu de réduction et donc que l’inhibiteur a fait son travail. Cela implique que le complexe inhibé ou l’un des complexes suivants joue un rôle dans la réduction.

Pour étudier la réduction du DPIP, on aura besoin d’un donneur d’électrons, le succinate. Le succinate est utilisé parce qu’il permet l’entrée d’électrons à haut potentiel dans la chaîne. Il est oxydé par le complexe II, ce qui va permettre l’entrée d’électrons, et il est transformé en fumarate. Ces électrons vont passer du complexe II vers le complexe III et IV en passant par la jonction Q. Cela rétablit également la consommation d’oxygène. Pour l’oxydation du DPIP, on utilise l’ascorbate, parce que c’est un réducteur puissant. L’ascorbate réduit le transporteur d’électrons, le TMPD, pour ensuite être données au cytochrome c qui subit une oxydation et pour enfin transférer les électrons au prochain complexe soit le IV.

Afin de trouver où le DPIP est réduit dans la chaîne de transport d’électrons, on a utilisé quatre différents inhibiteurs, soit le malonate, le cyanure (KCN), l’antimycine A et la roténone. Premièrement, le rôle de malonate est d’inhibé au complexe II, ce qui aura pour effet de ralentir l’utilisation du succinate, donneur d’hydrogène, par ce complexe. Donc, le complexe III recevra ses hydrogènes que par le complexe I. De même, le nombre de cytochrome c réduit diminuera, ce qui privera le cytochrome oxydase de son coenzyme donneur d’électrons, et aura pour conséquence d’utiliser moins d’oxygène et donc la respiration sera ralentie. De plus, étant donné que les complexes I, III et IV seront moins actifs, le pompage des protons sera ralenti. Tout ceci entraînera un manque d’énergie dû à l’activité du gradient de protons transmembranaires et donc la synthèse de l’ADP en ATP ne pourra pas s’effectuer.^[2] Deuxièmement, le rôle du cyanure est d’inhibé au complexe IV, ce qui arrêtera l’utilisation de l’oxygène et du cytochrome c par ce complexe. En effet, la réoxydation du cytochrome c sera ralentit et va priver le complexe III de son coenzyme, accepteur d’électrons. De plus, le manque de coenzyme Q oxydé entraînera également les complexes I et II d’être privé de leur coenzyme receveur d’hydrogène et donc ces enzymes utiliseront moins de NADH et de succinate. Pour ajouter, les complexes I, III et IV seront moins actifs, cela aura la même conséquence que le malonate par rapport à la synthèse de l’ADP en ATP.^[3] Troisièmement, l’antimycine A inhibe le complexe III, ce qui ralentit l’utilisation du coenzyme QH2 de ce complexe et du cytochrome c ferrique. Il y aura donc moins de cytochrome c réduit ce qui mène au ralentissement de la respiration. Cela engendre un ralentissement de la réoxydation du coenzyme Q qui privera les complexes I et II de leur coenzyme accepteur d’hydrogène. Par la suite, ces enzymes utiliseront moins le NADH et le succinate. Pour ajouter, la même conséquence, dû au fait des complexes I, III et IV étant moins actifs, a lieu.^[4] Quatrièmement, la roténone inhibe le complexe I en ralentissant l’utilisation du NADH et du coenzyme Q. Le fait que le coenzyme Q est réduit entraîne que le complexe III reçoit ses hydrogènes seulement par le complexe II. Le manque de cytochrome c réduit et la baisse des protons pompés par les complexes I, III et IV a pour conséquence une réduction de la respiration et la réaction de synthèse de l’ADP en ATP ne peut pas s’effectuer. ^[5]