Tp Albumine

n ligand-molécule spécifique est moins stable. Généralement on modifie la concentration du solvant pour diminuer l'affinité (on utilisera ici le tampon B). Ces dernières se détacheront alors de la résine, élueront dans le solvant de désorption et pourront être récupérées.

Test au biuret et dosage colorimétrique à 540 nm :

En milieu alcalin, les protéines qui possèdent au moins 4 liaisons peptidiques forment avec les ions cuivre (Cu2+) un complexe bleu-violet.

Un dosage colorimétrique est donc possible à 540 nm. Le réactif de coloration utilisé est le réactif de Gornall ; il est composé :

* de sulfate de cuivre, qui donne la coloration bleu du réactif due aux ions cuivre ;

* d'hydroxyde de sodium, qui rend le milieu basique ;

* d'EDTA, qui chélate les ions Cu2+ et évite leur précipitation en milieu basique sous forme d'hydroxyde de cuivre Cu(OH)2 insoluble ;

* d'iodure de potassium, pour éviter la réduction du cuivre.

Un temps de réaction d'environ 30 minutes à l'obscurité est nécessaire à l'obtention d'une coloration stable. La lecture étant spectrophotométrique, il faut cependant réaliser une gamme d'étalonnage ainsi que des témoins de compensations adaptés.

Le dosage colorimétrique est basé sur la loi de Beer-Lambert qui établit une proportionnalité entre la concentration d'une entité chimique en solution, l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution.La loi de Beer-Lambert n'est cependant valable que sous certaines conditions. la lumière doit être monochromatique, la concentration des solutions doit être faible (de l’ordre de 10-4 mol.L-1), les solutions doivent être homogènes et le soluté ne doit pas réagir sous l’action de la lumière incidente.

On mesure l'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre. L'appareil génère une lumière monochromatique de longueur d'onde choisie qui traverse une cuve contenant la solution à analyser. Pour établir la valeur de l'absorbance pour une longueur d'onde donnée, l'appareil mesure la variation de l'intensité lumineuse induite par la traversée de la cuve contenant la solution à analyser.

La réalisation d'une gamme étalon permet d'établir expérimentalement la courbe A = f (C) reliant l'absorbance et la concentration de la substance étudiée en effectuant les mesures de l'absorbance pour diverses concentrations connues. Cette courbe est une courbe d'étalonnage. La courbe expérimentale d'étalonnage permet ensuite de déterminer la concentration inconnue d'une solution de cette substance par simple mesure de son absorbance et report sur le graphe A = f (C) .

La loi de Lambert-Beer a des limites. Elle n'est linéaire que dans un intervalle de concentrations réduit regroupant des valeurs inférieures à 10-2mol.l-1 .

Electrophorèse :

L'électrophorèse permet de séparer les différents constituants d'une solution en les soumettant à l'action d'un champ électrique. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, poreux et imprégné de tampon capable de conduire le courant d'un pôle à l'autre. Les particules se déplacent sous l'effet du courant à des vitesses différentes, en fonction de leur taille et de leur charge électrique. La taille des mailles du support/gel d'électrophorèse a une influence dans la vitesse de migration des particules, c'est pourquoi on choisi un support adapté aux molécules que l'on souhaite séparer afin d'obtenir une meilleure migration.

Pour un couple support/tampon donné, chaque substance à une vitesse de migration caractéristique qui nous permet d'itentifier les constituants d'un mélange en comparant leur front de migration avec ceux de dépôts témoins.

Spectrophotomètre

Un spectrophotomètre mesure la lumière absorbée par une solution (échantillon) à une longueur d’onde donnée, ce qui permet d’en déduire la concentration.

Un spectrophotomètre comprend :

- Une source de lumière polychromatique (lampe): elle émet un faisceau de lumière en direction du monochromateur.

- Un monochromateur (réseau + fente) : le réseau (système dispersif) décompose la lumière et dévie les rayons suivant leur longueur d’onde (apparition des radiations colorées de la lumière). La fente ( système sélectif) permet d'isoler une radiation lumineuse de longueur d’onde donnée. Cette radiation est dirigée vers la cuve contenant la solution à analyser.

- Une cuve (transparente aux radiations sélectionnées par le monochromateur) contenant la solution à étudier.

- Un photocapteur : c’est un élément photosensible (en général une diode) qui transforme le signal lumineux en signal électrique. En effet, le flux lumineux transmis par la solution (d’intensité inférieure au faisceau incident car les molécules de la solution en ont absorbé une partie) est dirigé vers ce photocapteur qui fournit au détecteur électronique un courant électrique proportionnel à la quantité de photons du flux lumineux.

- Un calculateur: il traite le signal électrique pour calculer l’absorbance qui est proportionnelle à l’intensité du courant et donc liée (par la loi de Beer-Lambert : A = k × c) à la concentration de la solution.

RESULTATS/INTERPRETATIONS

-Le collecteur doit etre programmé sur 1,5 mL pour qu’il y ait dans chaque tube collectés le meme volume que dans les tubes de la gamme étalon. Pour qu’ainsi on puisse s’aider plus facilement de la courbe étalon.

-Les tubes 8 et 9 sont des tubes a blancs.

Tubes|1|2|3|4|5|6|7|8|9|

SMA (mL)|0|0,2|0,5|0,7|1|1,3|1,5|||

Eau distillée (mL)|1,5|1,3|1|0,8|0,5|0,2|0|||

Tampon B (mL)||||||||1,5||

Tampon A (mL)|||||||||1,5|

Biuret (mL)|2|2|2|2|2|2|2|2|2|

Albumine (mg)|0|0,78|1,95|2,73|3,9|5,07|5,85|||

Concentration en albumine (mg/mL)|0,000|0,52|1,3|1,82|2,6|3,38|3,9|||

Absorbance lue (à 540 nm)|0,0060|0,0248|0,0557|0,0779|0,1029|0,1320|0,1517|0,0314|0,0316|

Absorbance réelle|0,0000|0,0188|0,0497|0,0719|0,0969|0,1260|0,1457|||

En comparant la droite étalon avec le profil d’élution on obtient le tableau suivant :

Tubes|Absorbance réelle|Quantité de protéines en Mg|

1|0,0309|1,2 |

3|0,0427|1,65|

5|0,1439|4,1